page contents Your SEO optimized title page contents
خانه / آموزش / کامل ترین پاورپوینت آموزش طراحی پرایمر
طراحی پرایمر

کامل ترین پاورپوینت آموزش طراحی پرایمر

کامل ترین پاورپوینت آموزش طراحی پرایمر

طراحی پرایمر، مفاهیم و تعاریف

طراحی پرایمر

طراحی پرایمر صحیح برای درست انجام شدن یک واکنش PCR بسیار ضروری است. برای اکثیر یک قطعه با بهره وری بالا رعایت نکاتی ضروری است:

۱- طول پرایمر:

به طور معمول، طول ۲۲-۱۸ نوکلئوتید برای یک پرایمر بهینه است. اگر طول پرایمر کمتر باشد، احتمال اتصال غیر اختصاصی بالا می­رود و اگر از این محدوده بیشتر باشد، اتصال پرایمر به الگو در دمای اتصال سخت­تر می­شود.

۲- دمای ذوب پرایمرها:

دمای ذوب پرایمرها یا به اصطلاح Tm، دمایی است که نیمی از DNA دو رشته­ای از هم جدا می­شود و DNA تک رشته­ای ایجاد می­کند. Tm نشانگر پایداری DNA دورشته­ای است. پرایمرهایی با Tm 58-52 درجه­ی سانتی گراد معمولا بهترین نتایج را به دست می­دهند. Tm متاثر از محتوای GC یک توالی است.

۳- دمای اتصال پرایمرها:

دمای ذوب پرایمرها تخمینی از میزان پایداری هیبرید DNA-DNA است و در تعیین دمای اتصال خیلی اهمیت دارد. اگر دمای اتصال(Ta) خیلی بالا باشد، پرایمرها و الگو از هم جدا باقی می­مانند و اتصال صورت نمی­گیرد و اگر دمای اتصال خیلی پایین باشد تنها برخی از نوکلئوتیدهای پرایمرها به الگو متصل می­شود و اتصال درستی رخ نمی­دهد و محصولات غیر اختصاصی تولید می­شود. از فرمول Rychlik برای به دست آوردن Ta استفاده می­شود:

Ta= 0.3×Tm(primer)+ 0.7×Tm(product)−۱۴٫۹

۴- محتوای GC:

نسبت بازهای GC به کل بازها باید بین ۶۰-۴۰ درصد باشد.

۵- گیره GC(GC clamp):

وجود بازهای GC در ۵ باز انتهای ‘۳ پرایمرها(که به آن گیره GC گفته می­شود) اتصال اختصاصی در انتهای ‘۳ را بهبود می­بخشد(به علت اتصال قوی­تر بازهای G و C). در ۵ باز انتهایی سمت ‘۳ نباید بیش از G3 یا C قرار داشته باشد.

۶- ساختار ثانویه پرایمر:

حضور ساختارهای ثانویه­ای که تحت تاثیر برهم کنش­های بین مولکولی یا درون مولکولی ایجاد می­شوند، منجر به تولید محصول بسیار ناچیز PCR می­شود و یا اصلا محصولی تولید نمی­شود. وجود این ساختارهای ثانویه برخلاف اتصال پرایمرها به الگو و تکثیر عمل می­کنند. این ساختارها به میزان قابل توجهی دسترسی به پرایمرها را کاهش می­دهند.

– ساختارهای سنجاق سری(hairpins):

این ساختارها جزء برهم کنش­های درون مولکولی پرایمرها هستند و باید از آن­ها دوری شود. اگر انتهای ‘۳ پرایمر یک ساختار سنجاق سری با ΔG(انرژی آزاد گیبس، هرچه منفی­تر باشد، ساختار پایدارتر است) kcal/mol2- داشته باشد و یا یک ساختار سنجاق سری درونی با ΔG= -3 kcal/mol داشته باشد، معمولا قابل تحمل است و مشکلی ایجاد نمی­کند.

– دیمر خودی(self dimer):

دیمر خودی پرایمر ناشی از برهم کنش­های بین مولکول­های پرایمر(از یک جنس) است. معمولا در یک واکنش از مقادیر زیادی از پرایمرها نسبت به میزان الگوی PCR استفاده می­شود. وقتی پرایمرها تمایلشان برای اتصال به خودشان بیشتر از تمایلشان برای اتصال به الگو باشد، محصول PCR کمتری تولید می­شود. معمولا دیمر انتهای ‘۳ با ΔG= -5 kcal/mol و دیمرهای درونی با ΔG= -6 kcal/mol قابل تحمل هستند.

– دیمر متقابل(cross dimer):

دیمرهایی که براساس برهم کنش­های بین مولکولی بین پرایمرهای سنس و آنتی سنس(جلویی و عقبی) به وجود می­آیند. به طور معمول دیمرهای متقابل انتهای ‘۳ با ΔG= -5 kcal/mol و دیمرهای متقابل درونی با ΔG= -6 kcal/mol قابل تحمل هستند.

۷- تکرارها:

شامل تکرارهای دو نوکلئوتیدی که مدام در یک توالی تکرار می­شوند. حداکثر تعداد تکرارهای قابل قبول، ۴ تکرار دو نوکلئوتیدی است.

۸- Runs:

منظور پرایمرهایی با تکرارهای تک نوکلئوتیدی زیاد، پشت سر هم است که می­تواند باعث اتصال غیر اختصاصی پرایمر شود. به عنوان مثال AGCGGGGGATGGGG تکرارهای ۵ و ۴ تایی از G را دارد. حداکثر تعداد تکرار قابل قبول برای یک باز، ۴ جفت باز است.

۹- پایداری انتهای ‘۳:

منظور حداکثر میزان ΔG برای ۵ باز انتهایی ‘۳ است. انتهای ‘۳ نا پایدار(با ΔG منفی کمتر) منجر به اتصال­های اشتباه کمتری می­شود.

۱۰- از ساختارهای ثانویه الگو دوری کنید:

پرایمرها باید برای ناحیه­ای طراحی شوند که آن ناحیه ساختار ثانویه پایداری تشکیل ندهد. در غیر این صورت این ساختارهای ثانویه­ی پایدار اجازه اتصال پرایمرها به الگو را نمی­دهند.

۱۱- از همولوژی متقابل دوری کنید:

برای بالا بردن اختصاصیت پرایمرها باید از نواحی همولوگ دوری کرد. به عبارت ساده­تر، پرایمرها باید به گونه­ای طراحی شوند که نواحی دیگر ژنومی را نشناسند و آن­ها را تکثیر نکنند. با BLAST کردن پرایمرها این ویژگی بررسی می­شود.

۱۲- طول قطعه تکثیر شونده:

طول قطعه تکثیر شونده در qPCR نزدیک به ۱۰۰جفت باز و در PCR استاندارد نزدیک به ۵۰۰ جفت باز است. اگر جایگاه قرارگیری پرایمرها بر روی الگو را بدانید، طول محصول از فرمول زیر به دست می­آید:

طول محصول= (جایگاه پرایمر جلویی- جایگاه پرایمر عقبی)+۱

۱۳- دمای ذوب جفت پرایمرها:

یک جفت پرایمر(عقبی و جلویی) باید Tm نزدیک به هم داشته باشند تا بهترین کارایی را داشته باشند. اختلاف ۵ درجه سانتی گراد یا بیشتر مانع تکثیر می­شود.

درباره ی salman varmaghani

همچنین ببینید

پایگاه زیستی

چگونه مقاله نویسی را شروع کنیم؟

چگونه مقاله نویسی را شروع کنیم؟ اگر شما دانشجو یا علاقمند به پژوهش هستید حتماً …

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

For security, use of Google's reCAPTCHA service is required which is subject to the Google Privacy Policy and Terms of Use.

If you agree to these terms, please click here.

بزرگترین فروشگاه مجازی پژوهشی کشور رد کردن